Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) y su evaluación por métodos inmunoenzimáticos

Translated title of the contribution: Immunogenicity of Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) venom and its evaluation by immunoenzymatic methods

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Abstract

The immunogenicity of Bothrops atrox, "jergón", venom was studied using ELISA and Western Blot methods, as well as cross-reactivity patterns against venoms of Bothrops brazili, Lachesis muta and Crotalus durissus. For this purpose, New Zealand white rabbits (2 kg aprox) were immunized with four 500 μg doses of B. atrox venom in a period of 90 days. Antibody production was followed using ELISA technique, and title of hiper-immune serum was determined at the end of immunization protocol. Additionally, electrophoretic patterns of venoms were analyzed by SDS-PAGE and venom reactivity against obtained serum by ELISA and Western Blot. Immunization schedule allowed a pronounced antibody production since day 20 of protocol. At the end of process, serum title was 256000, which demonstrated both efficacy and usefulness of the developed procedure. On the other hand, studied venoms showed a heterogenic protein composition according to their electrophoretic patterns, whereas cross-reactivity values of 23,7%, 4,0% and 1,8% were obtained between B. atrox venom and B. brazili, L. muta and C. durissus venoms, respectively, using immunoenzymatic methods. According to our results, this procedure constitutes an initial step for further assays directed to optimization in immunoserum production for envenoming treatment and development of kits for diagnosis and species identification of snakes.

Translated title of the contributionImmunogenicity of Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) venom and its evaluation by immunoenzymatic methods
Original languageSpanish
Pages (from-to)335-341
Number of pages7
JournalRevista Peruana de Biologia
Volume18
Issue number3
StatePublished - Dec 2011

Bibliographical note

Funding Information:
La principal herramienta terapéutica contra estos accidentes es el empleo de antivenenos producidos en caballos, ovejas, cabras y conejos, elaborados con sueros obtenidos a partir de la inoculación de estos animales con el veneno de las serpientes de mayor importancia en salud pública de un país, tomando como punto de partida la incidencia de su mordedura en una determinada población (Theakston et al. 2003). En Perú, el Instituto Nacional de Salud, mediante el Centro Nacional de Productos Biológicos, es el encargado de elaborar diferentes tipos de antivenenos como el botrópico polivalente (el cual utiliza los venenos de B. atrox “jergón de la selva”, B. brazili “jergón shushupe”, B. pictus “jergón de la costa”, B. barnetti “macanche” y B. hyoprora “jergón”), el laquésico monovalente (empleando el veneno de L. muta “shushupe”) y el crotálido monovalente (obtenido a partir del veneno de C. durissus “cascabel sudameri-cana”). A pesar de la efectividad mostrada por estas preparacio-nes biológicas en el tratamiento de mordeduras ofídicas, existe escasa información sobre las características inmunoquímicas de los venenos utilizados para su producción, por lo que resulta crucial estudiar la potencial reactividad inmunológica cruzada presente entre estos venenos a fin de optimizar la producción de tales inmunobiológicos, así como para el desarrollo de sistemas de detección de venenos para la identificación de la especie de serpiente responsable de un envenenamiento a fin de seguir el tratamiento apropiado (Van Dong et al. 2003).

Funding Information:
Para el análisis de la reactividad inmunológica de los venenos de serpientes estudiados contra el suero anti-B. atrox, se empleó en primer lugar el método de ELISA. Mediante esta técnica se pudo determinar que los anticuerpos presentes en el suero hiperinmune reaccionaron con los venenos de serpientes, donde la densidad óptica más fuerte fue la obtenida entre el veneno de B. atrox y su antiveneno homólogo (Fig. 3). En estos expe-rimentos de titulación, se pudo observar también reactividad cruzada con los otros venenos de serpientes, donde el mayor valor correspondió a la reacción del suero hiperinmune con el veneno de B. brazili, seguido por títulos bajos contra los venenos de L. muta y C. durissus. Estos resultados indican que los venenos en estudio contienen proteínas estructuralmente relacionadas con los componentes del veneno de B. atrox, los cuales varían tanto en intensidad como en abundancia. Estos resultados deben ser correlacionados con los de otros métodos inmunoenzimáticos, siendo el más idóneo el de Western Blot (Li & Ownby 1994), ya que si sólo se utiliza un método para este tipo de análisis, se podría llegar a conclusiones e interpretaciones erróneas sobre la reactividad entre los venenos y antivenenos (Siigur et al. 2000). Por esta razón se evaluó de forma adicional la inmunogenicidad de los componentes de los venenos en estudio utilizando el ensayo de Western Blot, el cual consiste en primer lugar en la separación de los componentes proteicos del veneno mediante PAGE – SDS, para luego ser transferidos a membranas de nitrocelulosa y puedan así ser detectadas por los anticuerpos presentes en el suero hiperinmune obtenido. De este modo, la formación de inmunocomplejos es detectada de forma similar que en un ELISA indirecto. La Fig. 4b muestra el patrón característico de coloración de bandas correspondiente a los componentes inmunorreactivos de los venenos en estudio analizados previamente por PAGE – SDS (Fig. 4a). Esta meto-dología permite la visualización directa y la comparación de la reacción de un mismo suero con los componentes del veneno homólogo y los venenos heterólogos bajo las mismas condi-ciones. De esta manera se pudo observar que las proteínas de los venenos reaccionaron con el suero hiperinmune producido contra el veneno de B. atrox lo cual indica que la mayor parte de los componentes proteicos son potencialmente inmunogénicos. Estos resultados pueden correlacionarse con los de Chinonavanig et al. (1988), quien trabajando con el veneno de serpientes de Tailandia, encontró que los componentes de alto peso molecular fueron inmunogénicos, donde además otros componentes de menor peso molecular también lo fueron. En los demás carriles se pudo observar una reactividad inmunológica cruzada entre los anticuerpos del suero hiperinmune con las proteínas de los venenos de B. brazili (carril 2), L. muta (carril 3) y C. durissus (carril 4). La mayoría de estas bandas de reacción correspon-den a proteínas de alto y mediano peso molecular y con una elevada inmunorreactividad. Tales reacciones cruzadas entre los venenos de vipéridos han sido descritas antes para el caso de un antiveneno anti-C. atrox y los venenos de C. adamenteus, C. h. horridus y C. v. viridis de norteamerica (Minton 1979). En nuestro estudio, se obtuvieron resultados mediante ELISA, pero con esta técnica no se pudieron determinar los componen-tes específicos que contribuyen a la reactividad cruzada. En el caso del veneno de B. brazili (Fig. 6b, carril 2), las reacciones cruzadas ocurren con una intensidad casi similar a la del veneno homólogo, lo que indicaría un alto grado de conservación en la estructura de sus proteínas con las del veneno de B. atrox lo cual se correlaciona con los datos obtenidos por ELISA. Para el veneno de L. muta (Fig. 6b, carril 3), la mayor reactividad se concentró en componentes de alto y mediano peso molecular (20 – 60 kDa), donde se encuentran agrupados componentes como proteasas y otras toxinas hemorrágicas. Finalmente, el veneno de C. durissus (Fig. 6b, carril 4), reaccionó pobremente con el antiveneno, donde la mayor reactividad se concentró en un componente de alto peso molecular (>66 kDa) que podría corresponder a su L-aminoácido oxidasa.

Publisher Copyright:
© 2011 Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM.

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